在蘭花繁育、交易與保護領域，病毒病是潛伏的“無形殺手”，常導致葉片花葉、壞死、畸形，花朵褪色、斑駁甚至不開花，嚴重影響觀賞價值和種質資源。如同一位為幽蘭“診脈”的醫師，科學的病毒檢測過程能早期發現、精準診斷，阻斷傳播鏈條。以下是現代蘭花病毒檢測的核心流程。  

第一步：采樣——鎖定“診脈”部位  

核心原則：選擇癥狀典型或易感組織，確保樣本具有代表性且富含病毒。  

操作要點：  

部位選擇：  

葉片：優先采集帶有花葉、黃化、條紋、壞死斑等明顯癥狀的葉片。若無癥狀，則采集新生、活躍生長的嫩葉或心葉（病毒含量通常較高）。  

假鱗莖/根莖：對于某些系統性侵染的病毒，也可取少量假鱗莖組織。  
 

采樣方法：  

使用消毒的剪刀或打孔器，避免交叉污染。  

采集約0.1-0.5g的組織樣本。  

將樣本放入無菌、標記清晰的離心管中。  

注意事項：  

一株一管，防止交叉污染。  

樣本應保持新鮮，盡快檢測。如需運輸或暫存，可置于4°C冷藏或使用專用保存液（如RNA保存液），避免反復凍融。  

第二步：提取——分離“病毒指紋”  

核心目標：從植物組織中高效、完整地提取出病毒的遺傳物質（RNA或DNA）。  

常用方法：  

商業化試劑盒法（常用）：  

使用專門的植物病毒RNA/DNA提取試劑盒（如硅膠柱法、磁珠法）。  

流程：組織研磨→裂解→結合→洗滌→洗脫。  

優點：快速、簡便、得率高、純度好，適合批量處理。  

傳統方法（如CTAB法）：  

成本較低，但步驟繁瑣，耗時長，對操作要求高，現已較少用于常規檢測。  

關鍵點：整個過程需在潔凈環境下進行，使用無RNase/DNase的耗材和試劑，防止核酸降解。  

第三步：檢測——“診脈”定乾坤  

核心手段：利用分子生物學技術，特異性地“放大”并識別病毒的遺傳物質。  

主流技術：  

RT-PCR/PCR（逆轉錄聚合酶鏈式反應/聚合酶鏈式反應）  

原理：針對目標病毒設計特異性引物，通過PCR循環擴增其特異DNA片段（RNA病毒需先經RT反轉錄成cDNA）。  

流程：配制反應體系（模板RNA/cDNA、引物、dNTPs、酶、緩沖液）→上機擴增→瓊脂糖凝膠電泳→觀察是否有預期大小的條帶。  

特點：靈敏度高、特異性強、成本相對較低，是常用的檢測方法?？赏瑫r檢測多種病毒（多重PCR）。  

實時熒光定量PCR(qPCR/RT-qPCR)  

原理：在PCR基礎上加入熒光探針或染料，實時監測擴增過程。  

優勢：  

更高靈敏度：可檢測極低濃度的病毒。  

可定量：不僅能定性（有無），還能估算病毒載量。  

閉管操作：減少擴增后開蓋導致的污染風險。  

高通量：適合大規模篩查。  

應用：已成為檢測和研究的。  

免疫學方法（如ELISA-酶聯免疫吸附測定）  

原理：利用病毒特異性抗體與樣本中的病毒蛋白結合，通過酶促反應顯色來判斷。  

特點：操作相對簡單，無需昂貴儀器，適合田間初篩。但靈敏度低于PCR，且只能檢測到一定量以上的病毒蛋白。  

高通量測序(HTS)/宏基因組學  

原理：對樣本中所有核酸進行深度測序，分析序列信息以鑒定已知和未知病毒。  

應用：主要用于新病毒發現、復雜混合感染分析或疑難病例診斷，成本高，分析復雜。  

第四步：判讀——解讀“脈象”報告  

核心任務：根據檢測結果，做出科學、準確的診斷。  

判讀標準：  

PCR/qPCR：  

陽性：出現預期大小的特異性條帶（PCR），或擴增曲線呈典型的S型且Ct值低于設定閾值（qPCR）。  

陰性：無特異性條帶，或無擴增曲線/Ct值無限大。  

需設對照：必須包含陽性對照（已知含病毒的樣品）、陰性對照（健康蘭花或水）和空白對照（無模板），以確保結果可靠。  

ELISA：根據顯色深淺（OD值）與臨界值比較判斷陰陽性。